單核細胞增生李斯特菌核酸檢測試劑盒 (PCR法)

【產(chǎn)品概述】

李氏桿菌病是由單核細胞增生李斯特菌引起的一種急性或慢性傳染病。本病可分為子宮炎型、敗血型和腦炎型。在家畜中，綿羊的李氏桿菌病最為常見，并幾乎全為腦炎型，各種年齡和性別的綿羊都可患病；敗血型間或發(fā)生于10日齡以下的羔羊；子宮炎型多發(fā)生于懷孕最后兩個月的頭胎綿羊。山羊的病型與綿羊的相同。

本試劑盒應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法，可快速、準(zhǔn)確地定性檢測單核細胞增生李斯特菌DNA，適用于單核細胞增生李斯特菌的檢測、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

【檢測原理】

 以提取的待檢樣本的DNA為模板，在PCR反應(yīng)體系中，低溫條件下引物與互補的模板形成雙鏈，72℃時在Taq DNA 聚合酶作用下，以dNTP 為原料，以引物為復(fù)制的起點，沿模板合成一條新鏈。每個循環(huán)包括：高溫變性、低溫退火、適溫延伸三個過程。每一次循環(huán)使擴增的DNA 片段拷貝數(shù)放大一倍。經(jīng)過35 次循環(huán)，使擴增的DNA 片段放大了數(shù)百萬倍以上。將擴增產(chǎn)物進行電泳，經(jīng)核酸染料染色后，在紫外燈照射下，肉眼可見到DNA 片段的擴增帶。

【試劑盒組成】

* 質(zhì)控品說明：陰性質(zhì)控品用于對環(huán)境進行監(jiān)控，陽性質(zhì)控品用于對檢測試劑進行監(jiān)控。

【自備物品】

1.   儀器：分析天平、離心機、PCR 擴增儀、電泳儀、紫外凝膠成像儀(或紫外分析儀)、微波爐、組織研磨器、-20℃冰箱、可調(diào)移液器等；

試劑：DNA提取試劑、核酸染料(如EB、GoldView II)、DNA Marker(如TaKaRa 1.   DL2000)、Loading Buffer、1×TAE(電泳緩沖液)、瓊脂糖、雙蒸水等；

2.   耗材：稱量紙、吸頭、量筒、500ml錐形瓶等。

【使用方法】

注：所有試劑使用前須*解凍，混合均勻后于5,000rpm離心數(shù)秒后使用。

1. 樣本處理（樣本處理區(qū)）

待檢樣本的核酸提取可采用核酸提取試劑盒，具體提取方法請參照相應(yīng)說明書；陽性質(zhì)控品及陰性質(zhì)控品無需提取，已包裝在試劑盒內(nèi)，可直接使用。

2. 擴增試劑準(zhǔn)備（配液區(qū)）

取N個（N=陰性質(zhì)控品+待檢樣本+陽性質(zhì)控品）PCR反應(yīng)管，每管分別加入PCR反應(yīng)液19.6μl、PCR酶0.4μl (也可按照每頭份用量，計算N+1頭份PCR反應(yīng)液、PCR酶各自所需總量，兩者混勻離心后分裝20μl至單個PCR反應(yīng)管)。

擴增試劑加好后將所有PCR反應(yīng)管于5,000rpm離心10s，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

在上述的PCR反應(yīng)管中分別加入待檢樣本核酸提取物、陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品各5μl，蓋緊管蓋，于5,000rpm離心10s，轉(zhuǎn)移至擴增區(qū)。

 4. PCR擴增（檢測區(qū)）

         94℃ 3min；

         94℃ 30s

         55℃ 30s

         72℃ 30s

         72℃ 7min；

         4℃  Hold；

         設(shè)置25μl體系。

5. 電泳檢測（電泳區(qū)）

稱4g瓊脂糖放于500ml錐形瓶中，加入200ml 1×TAE電泳緩沖液，于微波爐中熔解，室溫冷卻10min后加入10μl核酸染料混勻。在電泳槽內(nèi)放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后將PCR擴增產(chǎn)物10~20μl，加入終濃度1×的上樣緩沖液，點樣于瓊脂糖凝膠孔中，100~120V電壓在1×TAE電泳緩沖液中電泳至溴酚藍處于凝膠1/2處（約30min），紫外燈下觀察結(jié)果。

    【結(jié)果判斷】

陽性對照出現(xiàn)320bp擴增帶、陰性對照無該位置的特異條帶出現(xiàn)（引物帶除外），實驗結(jié)果成立，否則視為無效。被檢樣品出現(xiàn)320bp擴增帶為單核細胞增生李斯特菌陽性，否則為陰性。

【注意事項】

1． 有關(guān)實驗室管理規(guī)范請嚴(yán)格按照行業(yè)行政主管部門頒布的有關(guān)基因擴增檢驗實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。

2． 實驗請嚴(yán)格分區(qū)操作：流程順序為配液區(qū)→樣本提取區(qū)→擴增區(qū)→電泳區(qū)。嚴(yán)禁器材和試劑倒流。

3． 試劑盒內(nèi)各試劑使用前，充分融化后請稍事離心。

4． 在-20℃保存的樣本裂解產(chǎn)物，應(yīng)在加樣前置室溫解凍，作短暫離心后使用。

5． 核酸染料低毒，應(yīng)于室溫條件避光保存，操作時應(yīng)戴上手套，染料和上樣緩沖液使用前也請離心使液體沉于管底。

6． 嚴(yán)格遵守操作說明可以獲得最H的結(jié)果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。

7． 反復(fù)凍融試劑將減低檢測靈敏度，建議在3次內(nèi)用完，請嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

【儲存條件及有效期】

-20℃保存，避免反復(fù)凍融，有效期6個月。

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